U molekularnoj biologiji dobar izbor pufera i priprema za različite korake izolacije DNA mogu biti razlika između prelaska na ekspresiju proteina ili otvaranja drugog maxi-prep kita za početak. Unatoč njihovoj presudnoj važnosti, recepti s tamponima često su upravo to - recepti napisani bez objašnjenja ili obrazloženja za različite komponente. Jedan takav pufer je glukoza-tris-EDTA ili GTE pufer.
$config[code] not foundZa što se koristi GTE?
GTE se koristi za resuspendiranje bakterijskih staničnih peleta prije liziranja (razbijanja) stanica i žetve plazmidne DNA unutar. Lizozim, koji omekšava stanične membrane, često se dodaje zajedno s GTE puferom. Postizanje homogene suspenzije cijelih stanica tijekom tog koraka, tako da naknadno dodana otopina lize može doći do svih stanica, ključna je za dobivanje dobrih prinosa DNA. GTE je osmišljen kako bi to učinio dok istovremeno osigurava stabilno okruženje za DNK.
Glukoza za Osmolarnost
50 mM (milimolarni) glukozni šećer se dodaje u GTE pufer za održavanje osmolarnosti gdje je koncentracija otopljene tvari izvan stanica blizu one unutar stanica. Time se sprječava prijevremeno liziranje stanica, što može uzrokovati niži prinos DNA zbog agregacije i degradacije. Druge komponente pufera također doprinose osmolarnosti otopine, ali glukoza, kao ne-elektrolit, dobar je izbor jer ne ometa svojstva pufera otopine.
Tris za pH stabilnost
Tris je kratki naziv za tris (hidroksimetil) aminometan, koji je vrlo čest pH pufer. U slučaju GTE pufera, kisela sol (Tris-HCl) je dodana u pufer u koncentraciji od 25 mM. Time se održava pH otopine kod gotovo fiziološkog 8,0, idealno pH za sprečavanje kiselinske hidrolize (razgradnje) plazmidne DNA i neželjenih sporednih reakcija drugih staničnih komponenti.
EDTA sprječava razgradnju DNA
EDTA, ili etilendiamintetraoctena kiselina, hvata ili "kelira" metalne ione izvan otopine, sprječavajući ih da sudjeluju u neželjenim sporednim reakcijama. U GTE puferu doda se EDTA pri 10 mM. Njegova primarna svrha je u puferu za zaokruživanje slobodnog cinka, magnezija i kalcija, čime se sprečava degradacija DNA određenim putovima koji zahtijevaju te metale.
Neki važni savjeti
Držite GTE tampon hladnim i napravite ga u malim količinama kako biste spriječili rast neželjenih bakterija u njemu. Šećer i kontrolirani pH čine veliki medij za rast. Uvijek koristite pročišćenu vodu. Voda iz slavine može imati višak metalnih iona iz cijevi, što može nadvladati sposobnost EDTA da uhvati. Ako sumnjate na prisutnost interferencijske RNA u vašem uzorku, dodajte RNase A na 100 mikrograma po mililitru u vaš GTE pufer kako biste uklonili problem.
